清华施一公研究组发文报道处于激活前状态的两个完全组装酿酒酵母剪接体高分辨率电镜结构

 这两个整体分辨率分别为3.3-4.6埃和3.9埃的高分辨率三维结构首次展示了在剪接体组装过程中pre-mRNA的5’剪接位点和分支点（BPS）的识别状态与动态变化，回答了剪接体激活前pre-mRNA的5’剪接位点和分支点识别机理，以及激活过程中5’剪接位点和分支点如何逐步进入活性位点、剪接体如何逐步组装并通过结构重组最终完成激活等重要问题。

 RNA剪接是真核生物基因表达调控的重要环节之一。上世纪70年代，科学家们首次发现真核生物基因的不连续性，从而表明遗传信息从DNA转移到RNA上之后，需要经历有效遗传信息的“剪断”与重新“拼接”，这种有效遗传信息的拼接与“无效”遗传信息的去除，被称为RNA剪接。RNA剪接普遍存在于真核生物中，随着物种的进化，含有内含子的基因数量增加，发生RNA剪接的频率也相应增高，使得一个基因编码多个蛋白质成为可能。RNA剪接的本质是两步转酯反应，这种看似简单的化学反应在细胞中难以自行发生，而负责执行这一化学反应的是细胞核内一个巨大且高度动态变化的分子机器——剪接体（spliceosome）。在剪接反应过程中，多种蛋白质-核酸复合物及剪接因子按照高度精确的顺序发生结合和解聚，依次形成预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP（U4/U6.U5三小核核糖核蛋白复合物）以及至少8个状态的剪接体pre-B、B、B^act、B*、C、C*、P以及ILS复合物。

 由于剪接体高度的动态性和复杂性，获得不同状态的剪接体的高分辨率三维结构被公认为世界难题。施一公教授率领研究组迎难而上，经过7年的努力，终于在2015年首次报道了裂殖酵母剪接体3.6埃的高分辨率结构，首次展示了剪接体催化中心近原子分辨率的结构。这一重大研究成果对RNA剪接机理的研究产生革命性影响。

 自2015年第一个剪接体结构发表以后，施一公研究组相继解析了酿酒酵母剪接体复合物处于6个不同状态的高分辨率结构，分别是3.8埃的预组装复合物U4/U6.U5 Tri-snRNP、3.5埃的激活状态复合物B^act complex、3.4埃的第一步催化反应后复合物C complex、4.0埃的第二步催化激活状态下的C* complex、3.6埃的完成两步转酯反应后状态下的P complex，以及3.5埃的内含子套索剪接体ILS complex的结构。这些已解析的剪接体基本覆盖了整个RNA剪接循环，从分子层面揭示了剪接体催化RNA剪接两步反应的工作机理，同时为理解剪接体的激活和解聚等过程的发生提供依据。

 然而，目前还没有清楚解释剪接体是如何逐步组装并完成激活的机制，而最新发表的这篇文章所解析的两个关键状态的剪接体，则弥补了领域内对这一部分研究的空白。

 本文报道的处于激活前的两个完全组装的剪接体结构，从复合物的提纯、样品的制备到结构的解析，每一步都十分具有挑战。预催化剪接体前体（pre-B complex）由U1 snRNP、U2 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP组成，目前被认为是组成蛋白最多、分子量最大的剪接体，该状态结构复杂，但各组分之间的相互作用并不紧密，使得该复合物在提纯过程中十分容易解聚。在最新发表的这篇《科学》文章中，施一公研究组对提纯方案多次探索，最终优化出一套可以获得稳定的、性质良好的pre-B complex样品。随后利用单颗粒冷冻电镜技术重构出了U1 snRNP、U2 snRNP以及U4/U6.U5 tri-snRNP部分分辨率高达3.3埃、3.6-4.6埃以及3.4埃的冷冻电镜结构，并搭建了原子模型。